Page History

...

1. Pobierz, a następnie załaduj do Chipster pliki  (używając polecenia File -> Import files) pliki :
   adrenal_1.fastq
   adrenal_2.fastq
   brain_1.fastq
   brain_2.fastq
   chr19_hg19.bed
   chr19_iGenomes_GRCh37.gtf
   
   
2. Mapowanie odczytów do genomu referencyjnego.Narzędzie: Alignment -> Bowtie2 for paired end reads.  Przed wyborem narzędzia i parametrów zaznacz pliki adrenal_1.fastq oraz adrenal_2.fastq. Wybieramy narzędzie i parametry:

• Genome: Homo_sapiens.GRch37.75
• No 1 mate reads: plik zawierający odczyty „forward” (zazwyczaj z ‘_1’ albo ‘f’ w nazwie): adrenal_1.fastq
• No 2 mate reads: plik zawierający odczyty „reverse” (zazwyczaj z ‘_2’ albo ‘r’ w nazwie): adrenal_2.fastq
  
  Powtórz procedurę dla plików brain_1.fastq i brain_2.fastq. Przejrzyj dostępne wizualizacje plików wynikowych. W wizualizacji genome browser wybieramy należy wybrać ten sam genom, który był użyty do mapowania. Dane są dostępne dla rejonu: Chr19:3000000:3500000.

1. Analiza jakości mapowania. Narzędzie: Quality Control -> RNA-seq quality metrics with RseQC. Narzędzie uruchom należy uruchomić na pliku BAM uzyskanym z mapowania w poprzednim kroku oraz załadowanym pliku chr19_hg19.bed. Przeanalizuj otrzymane wykresy oraz informacje diagnostyczne.Powtórz mapowanie wybierając tym razem narzędzie Bowtie2 for single-end reads. Ustaw podobne opcje, wybierając do mapowania wyłącznie plik adrenal_1.fastq. Powtórz analizę dla pliku brain_1.fastq. Porównaj wyniki uzyskane z zastosowaniem tylko odczytów z jednego końca oraz z obu końców przez analizę wynikowego pliku BAM programem RseQC (patrz punkt 3) oraz przez wizualizację plików bam w przeglądarce genomowej. Po analizie wyników usuń wyniki otrzymane w tym punkcie, aby nie przeszkadzały w dalszych analizach.
2. Zliczanie ilości odczytów zmapowanych w obrębie genów. Narzędzie RNA-seq -> Count aligned reads per genes with HTseq-count. Uruchamiamy dla plików bam uzyskanych z mapowania paired-end z użyciem bowtie2. Parametry:
   
   • Reference organism: Homo_sapiens.GRch37.75
   • Does the BAM file contain paired-end data: yes
   • Was a data produced with a strand-specific protocol:

...

1. • yes 
2. Zdefiniowanie układu eksperymentalnego. Narzędzie: Utilities -> Define NGS experiment. Uruchamiamy na plikach plikach htseq-count.tsv z  z poprzedniego kroku (zanzaczyć oba przed uruchomieniem). W opcjach należy zaznaczyć kolumnę zawierającą zliczenia w obrębie plików wybranych do analizy, w naszym przypadku „count”. Po uruchomieniu powstaje tabela łącząca zliczenia z obu plików oraz plik plik phenodata.tsv. Plik ten należy zaznaczyć i w oknie wizualizacji wybrać wybrać Phenodata editor. Teraz należy przyporządkować próbki do grup eksperymentalnych. W naszym przypadku nie mamy replikatów, więc sample001.tsv opisujemy w kolumnie „group” jako „adrenal”, natomiast sample0002.tsv jako „brain” i naciskamy „close”.
3. Testowanie statytyczne genów pod względem różnicowej ekspresji. Narzędzie: RNA-seq -> Differential expression using edgeR. Narzędzie uruchom na plikach otrzymanych w poprzednim kroku. Parametry pozostaw domyślne. Przeanalizuj wykresy diagnostyczne oraz listę genów ulegających statystycznie istotnej różnicowej ekspresji. 

...